Argonautes(Ago)蛋白家族，在基因表达和防御外来核酸中发挥关键作用，能被寡核苷酸引导识别特定的核酸靶标。相较于CRISRP/Cas系统，gDNA/Ago系统具有无需PAM、gDNA简单且稳定等优点，在分子诊断和基因编辑方面具有极大应用潜力。其中，来自嗜热栖热菌的Ago(TtAgo)以DNA为引导，对单链DNA(ssDNA)具有高效的切割活性，但对dsDNA的切割活性较差，特别是在相对较低的温度(<70℃)下，这归因于gDNA与靶dsDNA的同源链具有相同的结合亲和力，TtAgo-gDNA复合物几乎不会侵入靶dsDNA激活Ago活性。因此，增加gDNA的结合亲和力来增强TtAgo的dsDNA切割活性并开发新型等温扩增方法对于快速分子诊断十分重要。
/研究内容/
Research Content
据报道，在糖、骨架、核酸碱基的3'和5'端进行适当化学修饰可以显着增加其与互补DNA的结合亲和力。此外，氟具有高度电负性，且2'-氟(2'F)寡核苷酸采用C3'-内构象，可也可显著增加结合亲和力，并使解链温度(Tm)增加。故作者首先假设2'F修饰的gDNA可能比典型gDNA能更好地激活dsDNA切割。为了验证这一假设，作者进行了Tm分析、生物分子相互作用分析和分子对接分析，如图1所示。这些数据共同表明，2′F-gDNA能够促进TtAgo-gDNA-靶标三元复合物的形成，增强TtAgo的dsDNA切割活性。
图1：2'F修饰的gDNA促进TtAgo-gDNA-靶标三元复合物的形成。 (A)F1-gDNA和C-gDNA之间的Tm比较。(B)链置换分析图示。 (C)FAM标记的F1-gDNA和C-gDNA之间链置换能力比较。(D)图1C中基于灰度值的数据。 (E)F1-gDNA 的结合亲和力。 (F)G-gDNA的结合亲和力。(G) gDNA/TtAgo/靶标三元复合物的组装效率分析。 (H)组装效率分析。
图4：FAST检测原理。(A)FAST检测原理。(B)FAST引发G4生成的PAGE分析。(C)基于ThT的实时FAST检测。
为了研究FAST的性能，作者构建了以microRNA-21(miR-21)为代表的检测平台，并与基于C-gDNA/TtAgo辅助等温核酸检测（CAST）平台进行了比较。结果表明，FAST对microRNA检测具有高灵敏性和高特异性。
图5：FAST用于microRNA检测。(A)FAST灵敏度分析。(B)FAST终点法荧光定量测量。(C) CAST灵敏度分析。(D)CAST终点法荧光定量测量。CAST 是指规范的 gDNA/TtAgo 辅助等温核酸检测。(E)和(F)FAST特异性分析。
为了验证FAST的实用性，作者比较了FAST和RT-PCR对几种产miR21的细胞系及其培养上清液的分析性能，结果表明FAST检测方法对于核酸检测具有较高的灵敏度和良好的实用性。
图6：FAST测定的实际应用。 (A)用于细胞提取物和培养上清液中miR-21检测的FAST测定。 (B)用于miR-21检测的RT-PCR。 (C)图6B中细胞提取物和培养上清液的Ct分布。 (D)FAST和PCR的性能比较。
/总结/
Summarize
作者发现TtAgo的dsDNA切割活性差的根本原因是gDNA、TtAgo和靶标之间的分子间作用力较弱，这阻碍了TtAgo-gDNA-靶标三元复合物的形成。基于此，开发了基于原子修饰的FATE策略来提高gDNA的Tm和结合亲和力，从而显著增强TtAgo活性。此外，利用FATE建立了一种新颖的、超灵敏的、高特异性的等温扩增技术（FAST），为快速分子诊断提供了有效工具。
